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      Vigorous Biotechnology

      威格拉斯生物技術

      (北京)有限公司

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      PCR技術概述

      聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)的發明,是分子生物學發展過程中的一個里程碑。各種耐熱DNA聚合酶的使用,使PCR作為一個實用的技術,在生命科學研究中成為不可缺少的有力武器。 通過PCR,極微量的DNA目的片斷以指數擴增的形式大量復制,這使之前許多無法想象的研究工作能夠順利進行。許多改良或變異的PCR方法,可以使這項技術應用于復雜多樣的實驗中,獲得完全不同的效果。

      耐熱DNA聚合酶,是PCR中的核心成分。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,將脫氧單核苷酸逐個加到延伸的互補DNA鏈3’-OH末端,使目的片斷得以復制。Taq DNA聚合酶是最常用的PCR聚合酶,具有耐熱、擴增效率高等特點。但該酶沒有3’→5’外切酶活性,如果發生dNTP錯誤摻入,這種酶沒有校正能力,因此用Taq酶進行PCR,產物中點突變較多。由于Taq DNA聚合酶活性高,在熱循環啟動前就開始催化引物延伸,可能導致非特異性擴增。為提高PCR擴增的特異性,有時需要進行“熱啟動”,即在反應體系升溫到變性溫度后再加入Taq 酶啟動反應;一些特殊形式的Taq 酶稱為熱啟動酶,為可逆性失活的酶,可在反應前加入反應體系,但沒有擴增活性,當反應體系升溫到一定溫度后,酶活性被激活,催化擴增反應。另一種常用的PCR聚合酶是Pfu DNA聚合酶,該酶有很高的3’→5’外切酶活性,校正能力極強,但PCR擴增效率較低。其它不同類型的耐熱DNA聚合酶還有Vent、rTth、UlTma等,以及Taq和Pfu的各種突變分子。

      PCR體系中的鎂離子濃度,是影響DNA聚合酶效率的一個關鍵因素。過高的鎂離子濃度會導致非特異性擴增產物產生,而過低的鎂離子濃度則抑制擴增反應。 最適鎂離子濃度還與反應體系中的其它成分有關,如dNTP濃度和引物濃度。

      引物設計合成,是PCR擴增成功的關鍵因素。引物設計遵循的原則包括引物長度不少于16個核苷酸,而最高可達36個核苷酸以上,最佳長度為20~30個核苷酸;引物的GC含量和組成應均勻,盡量避免含有相同的堿基多聚體;引物內部應避免內部形成明顯的二級結構,如發夾結構;引物之間不應發生互補,特別是在引物3’端形成互補結構;設計引物的Tm值不能過低。 計算機輔助引物設計是目前流行的方法,但不同軟件的設計原則不盡相同,甚至Tm值的計算方法也大不相同,應留意所用軟件的使用說明,正確使用。有時因擴增片斷的特別需要,引物設計的選擇余地很少,只能在引物長度上仔細比較選擇。

      現行的熱循環儀一般都具有良好的升降溫效率和熱傳導功能,熱蓋設計也避免了液體蒸發對PCR的影響。配合薄壁PCR管的使用,熱循環時間比早期大大縮短。在PCR自動熱循環設置中,最關鍵的因素是退火溫度。通常將退火溫度設置在引物Tm值低5℃左右的范圍;提高退火溫度可減少非特異性擴增產物,而降低退火溫度可增加擴增產物的產量。PCR的指數擴增并非無限的,一般在25~30個循環后,擴增產物的量逐漸進入平臺期。

      本公司生產PCR技術相關的系列產品,包括各種用途的耐熱DNA聚合酶和試劑盒,為實驗室PCR工作提供幫助。

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